審評四部     張明平

    保證產品無菌是注射劑產品質量保證的核心問題。無菌生產工藝是保障注射劑產品無菌的關鍵手段。而只有經過充分驗證后的滅菌（無菌）生產工藝，才能保證生產出無菌的產品。微生物挑戰試驗是無菌生產工藝驗證的重要環節。而選擇適當的生物指示劑則是微生物挑戰試驗結果獲得認可的關鍵。本文將圍繞如何為終端滅菌工藝（過度殺滅和殘存概率法）選擇適當的生物指示劑進行討論。

    滅菌是指殺滅所有形式微生物的過程。在業界，常用“無菌保證水平”（Sterility Assurance Level,SAL）概念來評價滅菌（無菌）工藝的效果，SAL的定義為產品經滅菌/除菌后微生物殘存的概率。該值越小，表明產品中微生物存在的概率越小。為了保證注射劑的無菌安全性，G際上一致規定，采用濕熱滅菌法的SAL不得大于10-6，即滅菌后微生物存活的概率不得大于百萬分之一。生物指示劑就是為了保證整個滅菌過程達到SAL 水平而應用的,它能綜合反映影響滅菌效果的各種因素。因此為了保證驗證結果的重復性，生物指示劑應當采用標準化的菌株（即變異性小，各項生物學特征均一性好的菌種），并且應當具備合乎要求的抗力。更重要的是，參照USP的要求“It must be established that the biological indicator system provides a challenge to the sterilization process that exceeds the challenge of the natural microbial burden in or on the product.”，我們應當選擇比現有生產線自然環境下所發現的菌株更難殺滅的菌株來作為生物指示劑。舉例來說，比如通過對現有車間環境、生產線、人員、物料兩年的的連續觀測，發現在現有生產條件下所發現的菌株的D值**高不超過0.8，則選擇D值在0.8～1.5之間的生孢梭菌( Clostridium sporogenes；ATCC7955)為生物指示劑進行驗證就是不合適的。而如果在現有生產條件下所發現的菌株的D值**高不超過0.6，則可以選擇生孢梭菌為生物指示劑。

    只要滿足以上兩個原則（標準化菌株及合乎要求的抗力），生產企業可以自行選擇、研究、培養生物指示劑（前提是提供充分的生產環境和驗證菌株的研究資料）；也可以選擇商用的生物指示劑產品，如Bacillus stearothermophilus（嗜熱脂肪芽孢桿菌）、Clostridium Sporogenes（生孢梭菌）、Bacillus subtilis （枯草芽孢桿菌）、Bacillus coagulans（凝結芽孢桿菌）等菌種的孢子。不論采用何種驗證菌株，參照USP，對濕熱滅菌（121℃）的工藝驗證用菌株均應證明“具備合乎要求的抗力”；通常應滿足以下要求：D值在1.5～3.0之間；存活時間在4.5～14.0min之間；完全殺滅時間在13.5～32.0min之間。為了表征菌株的“抗力”，可參照USP<55> BIOLOGICAL INDICATORS—RESISTANCE PERFORMANCE TESTS的相關標準化程序，測定D值、存活時間和殺滅時間，并提交相關的驗證資料。

    但在大多數情況下，在申報新藥時G內企業缺乏對車間環境、生產線、人員、物料連續兩年的檢測資料。在這種情況下企業不能自行選擇“新”的生物指示劑，而應當選擇為目前業界熟知的一些生物指示劑。目前，嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(ATCC 7953)已成為驗證濕熱滅菌程序的**常用的生物指示劑。采用該菌株進行滅菌工藝驗證通常不再需要企業提供連續兩年的微生物環境監測結果。

    驗證過程通常為將一定量已知耐熱性的孢子接入產品中, 用設定的滅菌程序滅菌, 以確認設定的滅菌工藝是否符合標準。然而有的產品可能會增加微生物的耐熱性, 有的產品可能會殺滅微生物或與之不相容, 在后一種情況下, 可考慮用生理鹽水或與產品相似的溶液替代產品進行驗證試驗。所以研究滅菌程序之前, 必須了解生物指示劑在產品或替代產品中的耐熱性。即參照USP<55>的要求對D值進行測定。其中規定“The requirements of the test are met if the determined D value is within 20% of the labeled D value for the selected sterilizing temperature and if the confidence limits of the estimate are within 10% of the determined D value.”。即測定的D值應該為標定值的80～120%（置信區間為10%以內）。此外，企業有責任對購買的指示劑產品的純度和分類學特征進行研究，**少應當確定該微生物的“種”；并詳細說明供應商提供的菌種的D值范圍、適用的滅菌條件、存儲條件、出廠時間、過期時間、菌種穩定性等資料。當該生物指示劑存儲時間較長或者擬進行驗證的滅菌條件與生產商的說明不符時，必須重新測定指示劑的D值、存活時間和殺滅時間。

    在使用生物指示劑時容易忽視的一點就是——所有關于滿足SAL不得大于10-6的產品就是無菌產品的假設都是建立在原產品中的微生物量（bioburden，生物負荷）不超過每單位壹佰萬個。因此應當檢測生物指示劑每個單劑量中的微生物孢子數。參照USP要求“The requirements of the test are met if the average number of viable spores per carrier is not less than 0.3 log of the labeled spore count per carrier and does not exceed the log labeled spore count per carrier by 0.48.”；即單劑量包裝中的孢子數不低于標示量的0.3Log，亦不得過標示量的0.48Log。

    總而言之，選擇恰當的生物指示劑，執行正確的步驟，并提供系統完整的信息，才能使無菌生產工藝驗證結果令人信服。

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